Tutorial (Session 2) Functional Genomics English Hindi

Tutorial (Session 2)YouTube↗ IA↗(long shot)
People & Blogs 1.1K views 6 likes 0 dislikes 12 Jan 2017

Functional Genomics 994 subscribers N/A YouTube↗

Hello everyone I am Anshika your teaching assistance for the functional genomics course and today I will be taking a tutorial lecture in which I will be telling you about some of the interesting tools that we use to study genomics I will start with this slide in which I am show you schematics of a transcription cassette

सभी को नमस्कार, मैं कार्यात्मक जीनोमिक्स पाठ्यक्रम (functional genomics) के लिए आपकी शिक्षण सहायक हूं। और, आज मैं एक ट्यूटोरियल व्याख्यान ले रहा

So we all know that RNA polymerase binds to the promoter region and transcribe genes and to bind to the promoters they scan through the they look for the consensus regions which are present upstream of the promoter so as to locate the promoter We have been reading all these facts in our textbooks but ever wondered how these uhhh consensus regions

हूं जिसमें मैं आपको कुछ ऐसे दिलचस्प उपकरणों के बारे में बताऊंगा जिनका

were identified in the first place So it was a bit experimental techniques and mutation studies at these consensus regions were identified but uhhh are these why are they called consensus

उपयोग हम जीनोमिक्स का अध्ययन करने के

because consensus means these regions should be conserved throughout species and how was that done how was how are these consensus regions mapped across the species whether

लिए करते हैं। मैं इस स्लाइड से शुरू करूँगा जिसमें

they are conserved or not That was done through DNA sequences oborin sequences were compared massively compared across the across different species Here I am showing an example of prokaryotic operons

मैं आपको एक प्रतिलेखन कैसेट (cassette) की योजनाएँ

such as the tryptophan operons or the lactose operons or the lambda the bacteria fudge some of the bacteria fudge genes which are involved in those operon systems so comparing the DNA

दिखा रहा हूँ। तो, हम सभी जानते हैं कि आरएनए पोलीमरेज़

sequences upstream of the transcription start site revealed that they were several conserved regions in that region of the gene and these were it was then believed that these regions which are conserved are indeed the consensus region which helps the polymerase to locate the promoters

(RNA polymerase) प्रमोटर क्षेत्र को बांधता है और जीन को स्थानांतरित करता है, और वे जिन प्रमोटरों

So these conserved regions could also be called as motives which are which form the characteristics of the protein family and I would call them these are called as regulatory motives or in a DNA sequence or protein motives which even form the active sites where for docking of ligands How are these conserved sequences across the species are mapped like what was

के माध्यम से स्कैन करते हैं, उन्हें बांधने के लिए, वे आम सहमति क्षेत्रों

done after it was located that there is some conservation indeed present In case of DNA sequences the letters of the nucleotides ATGC were counted across the sequence

की तलाश करते हैं जो प्रमोटर के ऊपर

and the one which is present as maximum was thought to be the most important residue at that region and was thought to be conserved throughout evolution and hence matrices were

मौजूद होते हैं ताकि प्रमोटर का पता लगाया

built by scoring by these scoring and these kind of concepts algorithms were built for the to develop tools which would be used for massively for comparing thousands and thousands

जा सके। हम अपनी पाठ्यपुस्तकों में इन सभी तथ्यों

of sequences across different species So this is a an example a diagram which I am showing you which shows different DNA sequences which are matched and the yellow colour here close you uhhh the conserved regions across these different sequences so like I told you regulatory motives or these conserve sequence

को पढ़ रहे हैं, लेकिन कभी सोचा है कि इन सर्वसम्मति (consensus) वाले क्षेत्रों की पहचान पहले कैसे की गई थी।

they provide important starting points These were discovered by aligning the upstream regions of related genes before the transcription upside and hence and this is how the conserved regions were identified Tools such as multiple sequence alignment were thus developed on these lines to find

इसलिए, यह थोड़ा प्रयोगात्मक तकनीक था और इन आम

such conserved regions So multiple sequence alignment is generally align This is the classical definition as

सहमति वाले क्षेत्रों में उत्परिवर्तन

stated by the European Bio-informatics institution EBI you can go to this website and learn more about MSA So it is generally the alignment of three or more biological sequences proteins or nucleic acid DNA or RNA of ideally the same length and from the output the homology can be inferred and thus the evolutionary relationships between the sequences can be

अध्ययन की पहचान की गई थी। लेकिन क्या इनको सर्वसम्मति (consensus) क्यों कहा जाता है? क्योंकि आम सहमति का मतलब है कि इन क्षेत्रों

studied such as building of a phylogenetic tree which I will tell you later in my talk Multiple sequence apart from phylogene multiple sequence alignment has various applications Phylogenetic analysis can be done for discovering evolutionary relatedness that which species

को पूरी प्रजातियों में संरक्षित किया

are evolutionary more closer than discovering motives in DNA and proteins that which could be the motives and proteins which could be the docking site for ligands predicting a

जाना चाहिए। और यह कैसे किया गया था?

secondary structure of protein through homology modelling which could help again help in recognition

कैसे इन सर्वसम्मति (consensus) वाले क्षेत्रों

of different sites Which could be very import for that protein for the function of that protein Designing oligo nucleotides probes for microarrays now this is important because microarrays they can be used across different species which are closer to each other so designing

को प्रजातियों में मैप किया गया? उनका संरक्षण (consensus) होता है या नहीं?

such chips which has a region which has a probe which can wind to more than one species is of important also for gene cloning finding out restrictions enzymes restriction sites which are conserved across species is can be of importance And let me tell like how to do a multiple sequence alignment so we are all familiar

जो डीएनए (DNA) अनुक्रमों के माध्यम से किया गया था, या प्रोटीन अनुक्रमों की तुलना

with this website NCBINLMNIHGOV it has a data base of all the sequences the DNA –RNA protein sequences available and I am going to look for the evolutionary relationship or conserved regions across the genes which I have been working on It is called the heat shock protein

विभिन्न प्रजातियों में बड़े पैमाने पर की गई थी। यहाँ, मैं प्रोकैरियोटिक ऑपेरॉन (prokaryotic operons) जैसे

and it is expressed it is elevated in the cells in case of a stress condition such as

कि ट्रिप्टोफैन ऑपेरॉन (tryptophan operons) या लैक्टोज़

a bacterial or viral infection to help the cell combat that condition So heat shock proteins are know now they are known to be highly conserved through a different species and this is one of the reasons I took it in my study over here so HSPA4 is the heat shock protein that will be aligning so across different species so to start with you can

ऑपेरॉन या लैम्ब्डा द बैक्टीरिया फेज़ का उदाहरण दिखा रहा हूँ। कुछ बैक्टीरिया फेज जीन होते हैं जो उन

type the name of your gene whichever gene you are interested in aligning in this column and then from the drop down you can select protein and click on search

ऑपेरॉन सिस्टम में शामिल होते हैं।

So it will give you different HSPs that are across that are across different species so

इसलिए, प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल के

I thought this analysis i am starting with the homosapiens HSP70A4 gene so you just click on HSP70 homo sapiens A4 it will give you all the details of HSPA4 and as you browse down it will tell you more about the protein the what kind of protein it is and what kind of domains it has NCBI will tell you all about it You can browse down in read about it

ऊपर के डीएनए अनुक्रमों की तुलना करने पर पता चला कि वे जीन के उस क्षेत्र में कई संरक्षित क्षेत्र थे।

And here on the right side you can see this option as run blast now our first aim is to retrieve the sequences of HSPA4 from different species and then only we can subject it to

और, ये तब माना गया कि ये क्षेत्र जो

a tool which can look for conservation across the species So when we click when we do a blast then it will retrieve the HSP70 sequences across different species Click on run blast and what happens is that there is this NCBI tool called blast which

संरक्षित हैं वे वास्तव में सर्वसम्मति (consensus) क्षेत्र हैं जो पोलीमरेज़ को

you will read in another lecture taken by Nagma in so blast it will you just accession

प्रमोटरों का पता लगाने में मदद करते

number of the protein will automatically appear over here and then you can simply go down without changing any options just click the blast button and this window shows you a blast running So this is the output of the blast for HSPA4 gene So to to go directly to the different

हैं। इसलिए, इन संरक्षित क्षेत्रों को रूपांकनों (motifs) के रूप में भी कहा जा सकता है, जो

organism sequences of this HSP we click on the taxonomy reports And here below the organism report window option we get this window which shows as you browse down you will see that this for homosapiens and then this is for gorilla so as you browse down you will see the HSP protein sequences listed for different organisms

प्रोटीन परिवार की विशेषताएं हैं। और, मैं उन्हें विनियामक उद्देश्य (regulatory motives) या डीएनए अनुक्रम या प्रोटीन रूपांकनों

So as we browse down we can see that the HSP sequences for different sequence for different organisms like gorilla and chimpanzee or orangutan so you can simply select the organisms for which you can you want to do homology search and you can simply select those organisms how uhhh its a good idea to copy the accession numbers of those protein sequences from here

के रूप में कहा जाता हूं जो सक्रिय साइट बनाते हैं जहां लिगेंड्स (ligands) को डॉकिंग (docking) के लिए भी कहा जाता है।

So like you see in the previous slide there are below homo sapiens there are lots of hits generally the first hit is the one with maximum similarity so in case you are interested in a organism we go for the first hit and copy the accession number

प्रजातियों में इन संरक्षित अनुक्रमों को कैसे मैप किया जाता है?

So likewise for all the organisms we are interested in we copy all the accession numbers and paste it on a word file just like I did it over here We copy the accession numbers and then copy back the accession number from here and put it on the home page of the first page that I showed you of NCBI website and from the

जैसे कि यह स्थित होने के बाद क्या किया गया था कि वास्तव में कुछ संरक्षण

drop down again we select protein again search now what this will do

It will give you the sequences of just those proteins which you selected no other organisms Now what we want is we want the protein sequence of these organisms which we have sorted out in a faster format so for that we click on summary and you see this window pops up where

(conserved) मौजूद है? डीएनए अनुक्रमों के मामले में, न्यूक्लियोटाइड्स एटीजीसी (nucleotides ATGC) के पत्रों को अनुक्रम

there are two options fasta and faster text So fasta text gives you specifically the sequence of the protein with no other information which will be easier for you to copy paste and retrieve

में गिना गया था और जो उस क्षेत्र में

the sequence so we do that we click on fasta text and this is the kind of windows that appears You see there are protein sequences in the order mentioned in the for the different organisms

अधिकतम के रूप में मौजूद था, उस क्षेत्र

the protein sequences appear the same order Now we can do a little modulation here is that once we feed this these sequences to a alignment tool uhhh multiple sequence alignment tool it will take the first letter that comes that appears after the arrow and the that

में सबसे महत्वपूर्ण अवशेष माना जाता था और पूरे विकास में संरक्षित माना

will denote the sequence so we just modified this a bit and manually add the name of the organism the common name of the organism so that we can for the ease of understanding So that is what we do and I have copied this this I first copied this entire thing to a

जाता था। और, इसलिए इन स्कोरिंग द्वारा स्कोरिंग से मैट्रिसेस का निर्माण किया गया

notepad Any text editor you can use and you see before the accession number I have added the common name of the organism for the ease of my understanding like for humans for homosapiens chimpanzee for and monkey for and so on

था, और इस प्रकार की अवधारणाएँ, उपकरण विकसित करने के लिए एल्गोरिदम का निर्माण

Copy this information again and now we go to one of the multiple sequence alignment tools on the EBI website the European Bio-informatics institute and here like I have showed the

किया गया था, जो विभिन्न प्रजातियों में हजारों

definition of MSA to begin with They have defined MSA and the various tools for doing multiple sequence alignment uhhh mentioned at this website all these tools employ used different algorithms have been built to have been used to build these softwares and you

और हजारों अनुक्रमों की तुलना के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जा सकता है।

can explore each one of them individually and learn about their pros and cons Here I will use the most updated uhhh the recent one which is called Clustal Omega and you just click on launch Clustal Omega here and you get this window where you can paste all the sequences which you want to align and if you want to do a protein alignment

तो, यह एक उदाहरण है। एक आरेख जो मैं आपको दिखा रहा हूं जो अलग-अलग डीएनए (DNA) अनुक्रम (sequence) दिखाता है जो

like I told you DNA or RNA can also be aligned by using these tools So you select protein

from the drop down menu and simply paste your sequence from the notepad in this window We do not want to make any major alteration in the options let them read the default options

मेल खाते हैं और यहां पीला रंग आपको इन

you can always explore the other options available and click on submit The kind of window you get when the job is running please be patient This is the output that we get in case of Clustal Omega like you saw I changed the names of the organism till their common name now it is very easy to compare the different species

अलग-अलग अनुक्रमों में संरक्षित क्षेत्रों को दिखाता है। इसलिए, जैसा कि मैंने आपको विनियामक रूपांकनों

You see the sequences are aligned to each other and below the last sequence there are certain mark These symbols signify a star or an asterisk what you call signifies a complete match as you can see for yourself wherever this HSP gene like I told you is very is a

या इन संरक्षण (conserved) अनुक्रमों के बारे में बताया है, जो महत्वपूर्ण प्रारंभिक बिंदु

highly conserved protein known and you can see almost all below every nucleotide column you will see a star which means its highly conserved and protein is conserved throughout So an asterisk like I told you it means complete it means identical amino acids in case of

प्रदान करते हैं। ये प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल से पहले संबंधित जीनों के अपस्ट्रीम क्षेत्रों को संरेखित

a single dot that you see here there is change of one single amino acid which means all other single dot means there is just one amino acid different and all others are the same Whereas

करके खोजे गए थे और इसलिए और इसी तरह

two dots as you see here means there is more than one variation which is not evident in this over here but you can explore more and find out that is how the case is two dots

संरक्षित क्षेत्रों की पहचान की गई थी।

means more than one variation So this is the kind of output that we get upon doing a multiple sequence alignment and this can be used for various purposes which I have already talked about in the beginning uhhh here you see the options on the top

इस तरह के संरक्षित क्षेत्रों को खोजने के लिए इन लाइनों पर कई अनुक्रम संरेखण

The favourite application of multiple sequence alignment is building of phylogenetic tree that tells you relatedness of the species and you can draw it for yourself simply click on multiple sequence alignment This is you can browse below and see the output that you have got so you can see for the HSP there is very high degree of conservation and the

(alignment) जैसे उपकरण विकसित किए गए थे। इसलिए, कई अनुक्रम संरेखण (alignment) आमतौर पर संरेखित होते हैं।

asterisks are present all over the sequence Like you see here two dots so these two dots signify more than one amino acid is different whereas a single dot defines they just one variation and one of the sequence all other are the same So like I told you just click on the phylogenetic tree and here is the phylogenetic tree available

यह यूरोपीय जैव-सूचना (European Bio-informatics) विज्ञान संस्थान ईबीआई (EBI) द्वारा बताई गई शास्त्रीय परिभाषा है, आप इस वेबसाइट पर जा सकते

for the different organisms of your protein that you are analysing and here we can see that the distances the genetic distances calculated for each of the origins that will help us tell about the relatedness or the farness across the species like the monkey human and chimpanzee seems to be close as evident from the genetics distance calculated here

हैं और एमएसए के बारे में अधिक जान सकते हैं। तो यह आम तौर पर तीन या अधिक जैविक अनुक्रम

Let me tell you some interesting we have learned so far that what multiple sequence alignment is and how to do a multiple sequence alignment but let me tell you about some interesting

cases where people have used multiple sequence alignment and in clinical studies or to solve real life problems

प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड डीएनए या आदर्श

One of this is an attempt to build a vaccine against the Zika virus Now we have all heard about the deadly Zika virus it originated from it was identified in South African country

रूप से एक ही लंबाई के आरएनए के संरेखण

I think Uganda and later it spread to several different countries So Zika virus like its commonly known now is infected is transmitted by the bite of infected aides species of mosquitos and it is the passed through from a pregnant woman to her fetus and can cause birth defects So like I told you there is no vaccine for medicine vaccine or medicine for Zika

(alignment) है और आउटपुट से होमोलॉजी का अनुमान लगाया जा सकता है और इस प्रकार अनुक्रमों के बीच विकासवादी (evolutionary) संबंधों का अध्ययन किया जा सकता है।

And so this interesting study there I am going to show you here it resotic to other viruses which other viruses which are similar to Zika virus such as the Dengue virus and this like

जैसे कि एक फिलोगेनेटिक (phylogenetic) पेड़ का निर्माण

a common approach for building vaccines so what people do is that they look for viruses which are common to the one which is the common target and for the conserved domains Generally

जो मैं आपको बाद में अपनी बात में बताऊंगा।

uhhh vaccines against viruses are built looking for epitopes which are perturbed when the virus fuses with the host and those epitopes are considered as the favourite epitopes for building a vaccine It was this study what the author is tried to do was look for epitopes such epitopes

कई अनुक्रम फाइलोजेनी (phylogeny) के अलावा कई अनुक्रम संरेखण (alignment) विभिन्न अनुप्रयोगों है। फिलोगेनेटिक (phylogenetic) विश्लेषण विकासवादी

which for which the vaccines are already being made For the Dengue virus and if those epitopes are conserved in the Zika virus and then if hence if that is the case then it will be a beginning to build and vaccines against those epitopes that is what they did and this is a multiple sequence alignment output that I am showing from their study the first call

(evolutionary) संबंधितता की खोज के लिए किया जा सकता है कि कौन सी प्रजातियां विकासवादी

out the naming listed over here The first sequence is of the Zika virus and all others below it are from the different strains of Dengue virus so her we can see the colour pattern denotes the different degree of conservation The red colour show a high degree of or almost complete conservation

(evolutionary) अधिक निकट हैं। फिर डीएनए और प्रोटीन में मोटिफ्स की खोज करना जो कि मोटिफ्स और प्रोटीन हो सकते

and in the study they interestingly found that this this the fusion loop which which I just told you is important for finding the epitopes for preparing vaccines was form to be highly conserve between Zika virus and other strains of Dengue Which was good for the study such many more such studies were done to in an attempt to do the same

हैं जो लिगेंड्स के लिए डॉकिंग साइट हो सकते हैं। होमियोलॉजी मॉडलिंग के माध्यम से प्रोटीन की एक माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी करना

Also we have heard about you must have heard about the SRY gene or the sex determining

region Y which is responsible for male determining the sex of the fetus to maleness So what the

जो विभिन्न साइटों को पहचानने में फिर

study did was that they wanted to check across several species the homology of this SR they conserved pattern of this SRY gene if any So since this is such an important gene it determines the sex of the fetus the authors tried to compare it across different species such as human chimpanzee dogs pig rat cattle buffalo goat sheep and so on many more different

से मदद कर सकता है, जो उस प्रोटीन के कार्य के लिए उस प्रोटीन के लिए बहुत आयात कर सकता है।

species And this is the output from their studies that I am showing you the one on the top shows

सूक्ष्मजीवों के लिए डिजाइन करने

a multiple sequence alignment of the at the nucleotide level and the one below shows multiple sequence alignment at the protein level and the different colours here show different degrees of conservation and at the bottom you can see the sequence logo so the height denotes the degree of the conservation

वाले ओलिगो न्यूक्लियोटाइड्स जांच। अब यह महत्वपूर्ण है क्योंकि माइक्रोएरे का उपयोग विभिन्न प्रजातियों में किया

More the length of the nucleotide more it is conserved at that particular position and that is how consensus regions or conserved regions were figured out across the different species This is a very interesting exercise to do you can always go back to this research paper and do it for yourself you can retrieve the sequences of all these species for SRY

जा सकता है जो एक दूसरे के करीब हैं। इसलिए, ऐसे चिप्स(chips) को डिजाइन करना जिसमें

gene and see if you can get similar output or not This is about aligning the sequences again you can built a phylogenetic tree using the same tool which I told you in this paper the same they built that phylogenetic tree from

एक क्षेत्र हो, जिसमें एक जांच हो जो एक से

their output from this tree they inferred lot of interesting facts that the SRY protein sequences from the killer whale Orcinus Orca which we see here and the dolphin has the least genetic distance of 0.33 and our 99.67 percent identical at the amino acid level Also like we all know that homosapiens and chimpanzee are very close are known to be

अधिक प्रजातियों को बांध सकती है। इसके अलावा, जीन क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध एंजाइमों, प्रतिबंध साइटों, जो प्रजातियों में संरक्षित हैं, का पता लगाना महत्वपूर्ण

very close also evident from the study that they have the next closer genetic distance

of 1.35 and uhhh 0.65 percent identical at the amino acid level So it is indeed an interesting thing to study and you can always explore more from whatever I have told you in this

हो सकता है। और मुझे यह बताएं कि कैसे एक एकाधिक

talk So another important tool that we use in studies functional genomics studies is to run a PCR

अनुक्रम संरेखण (alignment) करना है, इसलिए हम

which you have which Dr Ganesha has taught you in of the lectures But to do a PCR we need a primer so how do we design a primer so let me tell you primers can be designed

सभी इस वेबसाइट NCBI.NLM.NIH.GOV से परिचित हैं।

for DNA or the RNA which is coded from the DNA from the at the genomic level or at the transcript level So today I will tell you how to design a primer to amplify a transcript present in the cell So here you see a PCR gel this is a normal PCR gel where we have DNA bands evident over

इसमें सभी अनुक्रमों, डीएनए, आरएनए का डेटा बेस है, प्रोटीन अनुक्रम उपलब्ध हैं। और, मैं उन जीनों के विकासवादी (evolutionary)

here which are stained by ethidium bromide tin which is eliminated in the UV light and

on the sides you see the ladder to know the size of the DNA band So this is a simple polymerase chain reaction which is done using primers and the DNA and then loaded on the gel to show you the product of the PCR So to design the primer for the quantify or identifying the presence of a transcript in

संबंधों या संरक्षित क्षेत्रों की तलाश करने जा रहा हूं, जिन पर मैं काम कर रहा

a cell We need to design a primer for that and I will show you here I will show you here about designing a primer for a gene called a GAPDH which is considered to be a constitutive gene uhhh expressing under all conditions and its level is not does not generally change across different conditions in the cell

हूं। इसे हीट शॉक प्रोटीन कहा जाता है और यह व्यक्त किया जाता है कि यह तनाव की स्थिति

So I will simply type GAPDH this is the symbol for the protein GAPDH it is one of the enzymes

in the glycolysis cycles Select gene over here so these are the different GAPDH across different species that they are listed over here and for which ever organism you want

के मामले में कोशिकाओं में ऊंचा हो जाता

to design a primer you can select that organism I will select human over here so you see all the information about this gene is listed over here The complete name glyseraldehyde 3 phosphate dehydrogenase and you see a little summary over here which tells you about the functions of this genes the known functions

है, जैसे कि बैक्टीरिया या वायरल संक्रमण से उस स्थिति का मुकाबला करने में मदद मिलती

of the gene You can browse down and explore more about the gene but here we want to design the primes so first we want to retrieve the sequence the transcript sequence of this the RNA sequence of this gene

है। इसलिए हीट शॉक प्रोटीन अब पता है कि वे विभिन्न

So we go down here you see the genomics sequence the RNA sequence the protein sequences all are listed for this gene The NM represents the transcript sequence click on that so this

प्रजातियों के माध्यम से अत्यधिक संरक्षित होने के लिए जाने जाते हैं।

is all about the mRNA of this gene It is a 1455 base pair long mRNA and all about it is listed below you can go through it to learn more feature about and we are interested in retrieving the FASTA sequence of this mRNA

और, यह एक कारण है कि मैंने इसे अपने

So just click on FASTA so this is the sequence mRNA sequence that we have obtained here Copy this sequence from here and open a word file paste a sequence over here Now an important thing to keep in mind while designing primers for detecting mRNA levels in the cell is that we do not want any non-specific bands present in the amplified in the PCR The primers that

अध्ययन में यहाँ लिया। तो, HSPA4 हीट शॉक प्रोटीन है जो विभिन्न प्रजातियों में संरेखित किया जाएगा। तो शुरू करने के लिए, आप अपने जीन का नाम

we design so it is important to keep in mind to design primers from different exons which bind to different exons panning in intron in between So that is important because during the process of splicing the intron is cleaved out the exons are ligated together so in the mature mRNA only the exons are stitched together

टाइप कर सकते हैं, जो भी जीन आप इस कॉलम में संरेखित करने में रुचि रखते हैं।

So uhhh if we design primers from different exons we will make sure that the final amplicon that we will get on our PCR is indeed from the mRNA and not from a genomic sequence where the primer might have a nil

और फिर, ड्रॉप डाउन से आप प्रोटीन का

Since in the RNA sample there can be some contamination some genomic DNA contamination and if there is an intron present in between then it will be a huge size and the primers will never be able to amplify that larger sequence Apart from this another thing which

चयन कर सकते हैं और खोज पर क्लिक कर सकते हैं।

is important is that while we are for designing a primer to amplifying mRNA sequence we experimentally what we do is that we isolate RNA and then prepare cDNA

तो, यह आपको अलग-अलग HSP देगा जो कि विभिन्न

So and from that that cDNA is what Is the template for this primers so it is important that in the synthesis of cDNA from the mRNA the polymerase might not have a very good

प्रजातियों में हैं। तो, मुझे लगा कि यह विश्लेषण मैं होमो

fidelity all the time and complete the transcription and complete the synthesis of the cDNA to till the end of the mRNA transcript and might just fall down so it is a always a good idea to design the primus towards the end of the transcript Since the end is 3 prime end since

सेपियन्स एचएसपी 70 ए 4 जीन के साथ शुरू कर रहा हूं।

the revserse transcript is starts synthesising the cDNA so we look for two exons which are last which are present towards the end of the transcript So we go back to the NCBI website where the information about the gene was given and here

तो आप बस HSP70 होमो सेपियन्स A4 पर क्लिक करें।

are the different exons that are listed here so the first exon is present from first base pair to 251 and so on

यह आपको HSPA4 के सभी विवरण देगा और जैसा

We can go down and for the exons the second one is from 352 to 458 and lets go towards the end so the last exon is from 1161 to 1435 we copy this information to our word file

कि आप नीचे ब्राउज़ करते हैं, यह आपको प्रोटीन के बारे में और बताएगा कि

and the one just before the second last exon is from 748 to 1160 just paste it before the

यह किस प्रकार का प्रोटीन है और इसके

last exon We now have the positions of the two exons and we will try to design the primes the forward

किस प्रकार के डोमेन हैं, एनसीबीआई आपको

from the last second exon and the reverse primes from the last exon So word will help

इसके बारे में सब बताएगा।

us do that and we need to an estimate of the number of nucleotides and in a row and we just select that and this tells us there are 17 nucleotides in the first row and we need to go until 748 so we count 10 rows that will be 700 and the 11 row will be containing the 748 nucleotide this is hopefully the 11 row and we give a space here Just to confirm this

आप इसके बारे में पढ़ने के लिए नीचे ब्राउज़ कर सकते हैं। और यहाँ, दाईं ओर आप इस विकल्प को देख

should make 700 thats what it is and now we need to go till 48 So we will just randomly select some region and this is 28 so we need to go for the this is 39 give a space so this is 48 so in fact the space should be over here because 748 the exons starts with delineating the exons boundaries and then this goes until so this

सकते हैं, जैसे कि ब्लास्ट (blast) को चलाते हैं अब हमारा पहला उद्देश्य विभिन्न प्रजातियों से HSPA4 के अनुक्रमों को प्राप्त करना है और उसके बाद ही हम

where the second last exon starts andso this is the region we are interested in for designing the primers So for amplifying targets you need to determine what kind of product size that you want so you it is always good to keep the product size low so that the conditions

इसे एक उपकरण के अधीन कर सकते हैं जो प्रजातियों में संरक्षण (conserved) के लिए देख सकता है।

can be for the PCR can be set such that the gene can be easily amplified So we will select a region such that we can get a 100 to 200 base pair amplicon and I select this region for designing the primer And now we go back to the NCBI blast tool NCBI primer blast tool We can simply type

इसलिए, जब हम क्लिक करते हैं जब हम ब्लास्ट (blast) करते हैं तो यह विभिन्न प्रजातियों में HSP70 अनुक्रमों को पुनः प्राप्त

that on Google and you will get that tool so this tool will help you design primers with the template sequence that you have to provide it This is the template sequence we can change the amplicon size that we desire Like i told you 100 to 2000 base pair and you can keep all other options the same and you can click

करेगा। रन ब्लास्ट पर क्लिक करें। और, क्या होता है कि यह NCBI उपकरण है जिसे

ब्लास्ट (blast) कहा जाता है, जिसे आप अनुपमा

on get primers Primer blast tool is designing primers for the sequence that we provided So we see here

द्वारा लिए गए एक अन्य व्याख्यान में पढ़ेंगे। तो, ब्लास्ट (blast) यह होगा कि आप प्रोटीन का केवल संख्या स्वतः ही यहाँ पर दिखाई

the tool has given us the sequence the different iso forms of GAPDH that a primer uhhh could

देंगे। और फिर, आप बस किसी भी विकल्प को बदलने के बिना नीचे जा सकते हैं, बस ब्लास्ट बटन

be annealing to so we can either select one particular iso form that we want the primers

पर क्लिक करें और यह विंडो आपको एक धमाका दिखाती है। तो, यह HSPA4 जीन के लिए विस्फोट का आउटपुट

to target or if you want to generally target the gene as a whole we cannot there is no

है। इसलिए, इस एचएसपी (HSP) के विभिन्न जीव अनुक्रमों पर सीधे जाने के लिए, हम टैक्सोनॉमी रिपोर्ट पर क्लिक करते हैं।

need to select

और यहाँ, जीव रिपोर्ट विंडो विकल्प के

Simply click on submit so the tool has design primers for us the different primers pairs

नीचे, हमें यह विंडो मिलती है जो दिखाता है कि आप नीचे ब्राउज़ करते हैं आप देखेंगे

that the tool has designed and our job is now to select a primer pair which is a which

कि यह होमो सेपियन्स के लिए है और फिर, यह गोरिल्ला के लिए है।

satisfies the requirement of a good primer that it should not bind non-specifically to

इसलिए, जैसा कि आप नीचे ब्राउज़ करते हैं, आप विभिन्न जीवों के लिए सूचीबद्ध

other sequences which we can find out from the results available here also it should

एचएसपी प्रोटीन अनुक्रम देखेंगे। इसलिए, जैसा कि हम नीचे ब्राउज़ करते हैं, हम देख सकते हैं कि विभिन्न जीवों

not have repetition of nucleotide repeats which would result in self-annealing of the

जैसे गोरिल्ला और चिंपांज़ी या आरंगुटान (orangutan) के लिए अलग अनुक्रम के लिए एचएसपी (HSP)

primer

अनुक्रम।

And there should be a uniform distribution of the nucleotide if they are if the primers are G series then that would pose difficulty in there binding and denaturation to the template

तो, आप बस उन जीवों का चयन कर सकते हैं, जिनके लिए आप गृहविज्ञान खोज करना चाहते हैं, और आप बस उन जीवों का चयन कर सकते हैं। कैसे?

इसका एक अच्छा विचार उन प्रोटीन अनुक्रमों के परिग्रहण संख्याओं को यहां से कॉपी करना है।

so these are the conditions that things that we need to uhhh keep in mind while preparing

इसलिए, जैसा कि आप पिछली स्लाइड में देखते हैं कि होमो सेपियन्स के नीचे कई हिट हैं।

while picking up a primer set So the first one is of 179 base pair apart from GAPDH it

आम तौर पर पहली हिट अधिकतम समानता के साथ एक है। इसलिए, यदि आप एक जीव में रुचि रखते हैं,

also binds well to the other transcript as well and the dots you see are due matches

तो हम पहले हिट के लिए जाते हैं और परिग्रहण संख्या की नकल करते हैं।

and the nucleotides specified are the mismatches so we will not go for this primer pair Let

इसी तरह, उन सभी जीवों के लिए जिनमें हम

s look at the second one It is a 104 nucleotide primer pair and it matches as well with other transcripts primer

रुचि रखते हैं, हम सभी परिग्रहण संख्याओं को कॉपी करते हैं और इसे एक शब्द फ़ाइल पर पेस्ट करते हैं जैसे मैंने यहां किया था।

हम परिग्रहण संख्याओं की प्रतिलिपि बनाते हैं और फिर यहाँ से परिग्रहण संख्या की प्रतिलिपि बनाते हैं। और, इसे पहले पृष्ठ के होम पेज पर डालें

pair 3 is 110 base pair and it gives it does match with other transcript but that is a

जिसे मैंने आपको NCBI वेबसाइट पर दिखाया था और ड्रॉप डाउन से फिर से हम प्रोटीन का चयन करते हैं, फिर से खोज करते हैं। अब, यह क्या करेगा?

यह आपको सिर्फ उन प्रोटीनों के अनुक्रम देगा, जिन्हें आपने चुना था, कोई अन्य जीव नहीं। अब हम जो चाहते हैं, हम इन जीवों का प्रोटीन

अनुक्रम चाहते हैं, जिसे हमने फास्ट (fasta) प्रारूप में हल किया है। तो, इसके लिए हम सारांश पर क्लिक करते हैं और आप इस विंडो को देखते हैं, जहाँ दो

very large amplicon of 3 more than 3 kb which is difficult to be amplified with the conditions

विकल्प हैं फास्ट (fasta) और फसा (fasa) पाठ। तो, फास्ट (fasta) पाठ आपको विशेष रूप से प्रोटीन का अनुक्रम देता है, जिसमें कोई अन्य जानकारी नहीं है जो आपके लिए पेस्ट

कॉपी करना और अनुक्रम को पुनः प्राप्त करना आसान होगा।

which we will be setting for this primer which will be like very stringent conditions so

तो, हम करते हैं कि हम फास्ट (fasta) पाठ पर क्लिक करते हैं और यह उस तरह की विंडोज़ है जो दिखाई देती है। आप देखते हैं कि प्रोटीन क्रम में विभिन्न

जीवों के लिए प्रोटीन क्रम एक ही क्रम में दिखाई देता है।

this is a good primer pair the primer pair 3 Again primer pair 4 is a good option so

अब, हम यहां थोड़ा मॉड्यूलेशन कर सकते हैं कि एक बार जब हम इन अनुक्रमों को एक संरेखण (alignment) उपकरण को खिलाते हैं, तो कई अनुक्रम संरेखण (alignment) उपकरण यह पहला

अक्षर लेगा जो तीर के बाद दिखाई देता है और जो अनुक्रम को निरूपित करेगा। इसलिए, हम इसे थोड़ा संशोधित करते हैं और मैन्युअल रूप से जीव का नाम जोड़ते

हैं, जीव का सामान्य नाम। ताकि, हम आसानी से समझ सकें। इसलिए, हम यही करते हैं और मैंने इसे कॉपी किया है मैंने पहली बार इस पूरी

चीज़ को एक नोटपैड पर कॉपी किया है।

this is how you can always explore

कोई भी टेक्स्ट एडिटर जो आप उपयोग कर सकते हैं। और, आप देख सकते हैं कि परिग्रहण संख्या से पहले मैंने अपनी समझ की आसानी के लिए

So the primer pair 6 does not seem to give us any non-specific matches so this seems

जीव का सामान्य नाम जोड़ा है। होमो सेपियन्स के लिए मनुष्यों की तरह, पान पैनिस्कस (paniscus) के लिए चिंपांज़ी और मुक्का के लिए बंदर और इतने पर।

इस जानकारी को फिर से कॉपी करें, और अब हम EBI की वेबसाइट यूरोपियन बायो-इंफॉर्मेटिक्स इंस्टीट्यूट पर कई अनुक्रम संरेखण (alignment) उपकरणों में से एक पर जाते हैं।

to be a good option and all we now have to do is that pick up these primer pair from

और, यहाँ जैसे मैंने MSA की परिभाषा को शुरू करने के लिए दिखाया है। उन्होंने एमएसए को परिभाषित किया है और इस वेबसाइट पर उल्लिखित कई अनुक्रम

संरेखण (alignment) करने के लिए विभिन्न उपकरण हैं। इन सभी उपकरणों का उपयोग विभिन्न एल्गोरिदम का इस्तेमाल किया गया है जो इन सॉफ्टवेयर्स

को बनाने के लिए उपयोग किए गए हैं और आप उनमें

here

से प्रत्येक को व्यक्तिगत रूप से खोज सकते हैं और उनके पेशेवरों और विपक्षों के बारे

And go back and match it to our sequence in the word file and make sure that these primer

में जान सकते हैं। यहाँ, मैं हाल ही में अद्यतन (updated) किए गए एक का उपयोग करूँगा जिसे क्लस्टल ओमेगा कहा जाता है।

और, आप बस यहां लॉन्च क्लस्टल ओमेगा पर क्लिक करें और आपको यह विंडो मिलती है, जहां आप उन सभी दृश्यों को पेस्ट कर सकते हैं जिन्हें आप संरेखित करना चाहते हैं।

और, यदि आप एक प्रोटीन संरेखण (alignment) करना

pairs they to the different exons that the the forward to the second last exon and the

चाहते हैं जैसे कि मैंने आपको डीएनए या आरएनए कहा है तो इन उपकरणों का उपयोग करके भी संरेखित किया जा सकता है। तो, आप ड्रॉप डाउन मेनू से प्रोटीन

का चयन करें और बस इस विंडो में नोटपैड से अपने अनुक्रम पेस्ट करें। हम विकल्पों में कोई बड़ा फेरबदल नहीं करना चाहते हैं।

reverse to the last exon so to do that we will have to first determine the boundaries

उन्हें डिफ़ॉल्ट विकल्पों को पढ़ने दें, आप हमेशा उपलब्ध अन्य विकल्पों का पता लगा सकते हैं और सबमिट पर क्लिक कर सकते हैं।

नौकरी चलाते समय जिस तरह की विंडो (window) मिलती है, कृपया धैर्य रखें।

of the 2 exons So the second last is until 1160 base pair so we can also colour these

यह आउटपुट है जो हमें क्लस्टल ओमेगा के मामले से मिलता है। जैसे आपने देखा कि मैंने जीवों के नाम उनके सामान्य नाम तक बदल दिए हैं अब

विभिन्न प्रजातियों की तुलना करना बहुत आसान है। आप देखते हैं कि अनुक्रम एक दूसरे से जुड़े हुए हैं और अंतिम अनुक्रम के नीचे

कुछ निश्चित निशान हैं।

exons so there is no confusion

ये प्रतीक एक स्टार या तारांकन (asterisk) चिह्न को कहते हैं, जिसे आप पूर्ण मिलान कहते हैं। जैसा कि आप देख सकते हैं कि यह HSP जीन जहाँ

भी मैंने आपको बताया है, वह एक अत्यधिक

This is yellow and this is to a different colour and now we can see we can match the

संरक्षित प्रोटीन है और आप लगभग हर न्यूक्लियोटाइड कॉलम के नीचे देख सकते हैं, तो आपको एक तारा दिखाई देगा, जिसका अर्थ है कि इसके अत्यधिक संरक्षण (conserved) और प्रोटीन का

संरक्षण (conserved) किया गया है। तो, जैसा कि मैंने कहा था कि यह एक समान एमिनो एसिड (amino acid) होता है।

primer pairs so the forward primer pair Lets so this is the primer pair and the forward

एक एकल बिंदु के मामले में जो आप यहां देखते हैं, एक एकल अमीनो एसिड का परिवर्तन होता है। जिसका मतलब है कि अन्य सभी, सिंगल डॉट

का मतलब है कि बस एक एमिनो एसिड अलग है और अन्य सभी समान हैं। जबकि, दो डॉट्स जैसा कि आप यहाँ देख रहे हैं, इसका मतलब है कि एक से अधिक भिन्नताएँ

हैं जो यहाँ पर स्पष्ट नहीं हैं, लेकिन आप अधिक खोज कर सकते हैं और पता लगा सकते हैं कि मामला कैसा है, दो डॉट्स का अर्थ एक से अधिक भिन्नता है।

तो, यह एक प्रकार का आउटपुट है जो हमें

will match exactly to the sequence that is over here whereas the reverse will match the

कई अनुक्रम संरेखण (alignment) करने पर मिलता है और इसका उपयोग विभिन्न उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है, जिनके बारे में मैंने शुरुआत में ही बात की है।

यहां आपको ऊपर की तरफ ऑप्शन दिखाई देंगे। कई अनुक्रम संरेखण (alignment) का पसंदीदा अनुप्रयोग फ़ाइलोजेनेटिक (phylogenetic) पेड़ का निर्माण

है, जो आपको प्रजातियों की संबंधितता बताता है और आप इसे अपने लिए आकर्षित कर सकते हैं। बस कई अनुक्रम संरेखण (alignment) पर क्लिक करें।

यह है कि आप नीचे ब्राउज़ कर सकते हैं और उस आउटपुट को देख सकते हैं जो आपको मिला है।

sequence in a reverse complimentary manner

तो, आप देख सकते हैं कि एचएसपी में बहुत अधिक संरक्षण (conserved) है और तारांकन पूरे अनुक्रम में मौजूद हैं।

So we can find the reverse compliment uhhh orientation of the reverse primer

जैसे आप यहां दो डॉट्स देखते हैं, इसलिए ये दो डॉट्स एक से अधिक अमीनो एसिड को अलग करते हैं, जबकि एक एकल डॉट परिभाषित करता है कि बस एक भिन्नता है और एक क्रम सभी

अन्य समान हैं। इसलिए, जैसा कि मैंने आपको बताया था कि आप केवल फ़ाइलोजेनेटिक (phylogenetic) ट्री पर क्लिक करते हैं और यहाँ आपके प्रोटीन के

विभिन्न जीवों के लिए फ़ाइलोजेनेटिक (phylogenetic) ट्री उपलब्ध है, जिसका आप विश्लेषण कर रहे हैं। और, यहां हम देख सकते हैं कि प्रत्येक

उत्पत्ति के लिए गणना की जाने वाली आनुवंशिक दूरी जो हमें बंदर, मानव और चिंपैंजी जैसी प्रजातियों के बीच की समानता या उसके बारे में बताने में मदद करेगी,

गणना की गई दूरी से स्पष्ट है। यहाँ।

And copy it from here and then try to match it with the last exon So this is where it

मैं आपको कुछ दिलचस्प बताऊं, हमने अब तक सीखा है कि एक से अधिक अनुक्रम संरेखण (alignment) और एक बहु अनुक्रम संरेखण (alignment) कैसे करें।

लेकिन मैं आपको कुछ दिलचस्प मामलों के बारे में बताता हूं जहां लोगों ने कई अनुक्रम संरेखण (alignment) का उपयोग किया है, और नैदानिक अध्ययन में या वास्तविक

जीवन की समस्याओं को हल करने के लिए।

matches So we are successful in designing primers which bind to different exons and

इनमें से एक ज़ीका (Zika) वायरस के खिलाफ एक टीका बनाने का प्रयास है। अब, हम सभी ने जानलेवा जीका वायरस के बारे में सुना है।

इसकी उत्पत्ति दक्षिण अफ्रीकी देश मुझे लगता है कि युगांडा में हुई थी और बाद में यह कई अलग-अलग देशों में फैल गया। तो जीका वायरस, जैसा कि आमतौर पर जाना

do not give non-specific matches in the NCBI prime last 2 So this is how we can design

जाता है, मच्छरों की संक्रमित सहयोगी प्रजातियों के काटने से संक्रमित होता है। और, यह एक गर्भवती महिला से उसके भ्रूण

को पारित किया जाता है और जन्म दोष पैदा कर सकता है। तो, जैसा कि मैंने आपको बताया कि ज़ीका (zika) के लिए कोई दवा वैक्सीन या दवा नहीं

है।

primers and I hope you enjoyed learning these two functional genomics tools which in today’s

और, इसलिए यह दिलचस्प अध्ययन वहाँ मैं आपको यहाँ दिखाने जा रहा हूँ। यह अन्य वायरस का सहारा लेता है जो अन्य वायरस जो जीका वायरस के समान हैं,

जैसे डेंगू वायरस। और, यह टीके के निर्माण के लिए एक आम दृष्टिकोण की तरह है। इसलिए, लोग क्या करते हैं कि वे उन वायरस

class and do go and explore more such tools and if you have any queries you can write

की तलाश करते हैं जो आम हैं जो लक्ष्य हैं और संरक्षित डोमेन की तलाश करते हैं। आम तौर पर वायरस के खिलाफ टीके उन एपिटोप्स

की तलाश में बनाए जाते हैं, जो तब होस्ट के साथ वायरस फ़्यूज़ होने पर ख़राब हो जाते हैं।

to us at the course portal Thank you

तथा,वैक्सीन बनाने के लिए उन एपिटोप्स को पसंदीदा एपिटोप्स माना जाता है। यह इस अध्ययन था कि लेखक को क्या करने की कोशिश की जाती है जो एपिटोप्स के

लिए ऐसे एपिटोप्स की तलाश करते हैं, जिनके लिए डेंगू वायरस के लिए पहले से ही टीके बनाए जा रहे हैं। और अगर, जीका वायरस में उन एपिटोप्स

का संरक्षण (conserved) किया जाता है और फिर यदि ऐसा है तो उन एपिटोप के खिलाफ टीके बनाने और टीका लगाने की शुरुआत होगी। यही उन्होंने किया और, यह एक एकाधिक अनुक्रम

संरेखण (alignment) आउटपुट है जो मैं उनके अध्ययन से दिखा रहा हूं। पहला नामकरण यहां सूचीबद्ध सूचीबद्ध है।

पहला अनुक्रम जीका वायरस का है और इसके नीचे के अन्य सभी डेंगू वायरस के विभिन्न उपभेदों से हैं, इसलिए यहां हम देख सकते हैं कि रंग पैटर्न संरक्षण (conserved) के विभिन्न

डिग्री को दर्शाता है। लाल रंग उच्च स्तर या लगभग पूर्ण संरक्षण (conserved) को दर्शाता है। और, अध्ययन में उन्होंने दिलचस्प रूप से पाया

कि यह संलयन पाश जो मैंने अभी आपको बताया था कि टीके तैयार करने के लिए एपिटोप्स खोजने के लिए महत्वपूर्ण है जीका वायरस और डेंगू के अन्य उपभेदों के बीच अत्यधिक संरक्षण

(conserved) पाया गया था। जो अध्ययन के लिए अच्छा था। ऐसे ही, और भी कई अध्ययन ऐसे ही करने के प्रयास में किए गए।

इसके अलावा, हमने आपके बारे में सुना है कि आपने एसआरवाई जीन या लिंग निर्धारण क्षेत्र वाई(Y) के बारे में सुना होगा, जो पुरुष के भ्रूण के लिंग का निर्धारण

करने के लिए जिम्मेदार है। तो, अध्ययन क्या किया गया था कि वे कई प्रजातियों की जांच करना चाहते थे, इस एसआर के होमोलॉजी वे इस एसआरवाई जीन के पैटर्न को किसी

भी रूप में संरक्षित (conserved) करते थे। इसलिए, चूंकि यह एक ऐसा महत्वपूर्ण जीन है जो भ्रूण के लिंग को निर्धारित करता है, लेखकों ने विभिन्न प्रजातियों जैसे

कि मानव चिंपांज़ी, कुत्तों, सुअर, चूहे, मवेशी, भैंस, बकरी, भेड़ और इतने पर इसकी तुलना करने की कोशिश की। प्रजातियों।

और, यह उनके अध्ययनों से आउटपुट है जो मैं आपको दिखा रहा हूं। शीर्ष पर एक न्यूक्लियोटाइड स्तर पर कई अनुक्रम संरेखण (alignment) दिखाता है और, नीचे एक प्रोटीन

स्तर पर कई अनुक्रम संरेखण (alignment) दिखाता है। और, यहां अलग-अलग रंग संरक्षण (conserved) के विभिन्न डिग्री दिखाते हैं और सबसे नीचे आप अनुक्रम

लोगो देख सकते हैं, इसलिए ऊंचाई संरक्षण (conserved) की डिग्री को दर्शाता है। अधिक, न्यूक्लियोटाइड की लंबाई अधिक यह उस विशेष स्थिति में संरक्षित है।

और, इस तरह से विभिन्न क्षेत्रों में सर्वसम्मति (consensus) वाले क्षेत्रों या संरक्षित क्षेत्रों का पता लगाया गया। यह करने के लिए एक बहुत ही दिलचस्प

अभ्यास है आप हमेशा इस शोध पत्र पर वापस जा सकते हैं और इसे अपने लिए कर सकते हैं, आप एसआरवाई (SRY) जीन के लिए इन सभी प्रजातियों के अनुक्रमों को पुनः प्राप्त

कर सकते हैं और देख सकते हैं कि क्या आप समान आउटपुट प्राप्त कर सकते हैं या नहीं। यह अनुक्रमों को संरेखित (aligning) करने के बारे में है।

फिर से, आप उसी उपकरण का उपयोग करके एक फ़ाइग्लोजेनेटिक ट्री बना सकते हैं, जो मैंने आपको इस पेपर में बताया था कि उन्होंने अपने आउटपुट से उस फ़्लोजेनेटिक

ट्री का निर्माण किया था। इस पेड़ से उन्होंने बहुत सारे दिलचस्प तथ्यों का अनुमान लगाया कि हत्यारे व्हेल ओरसिनस ओर्का से एसआरवाई प्रोटीन

अनुक्रम जो हम यहां देखते हैं और डॉल्फिन में 0.33 की आनुवंशिक दूरी कम से कम है और हमारी 99.67 प्रतिशत अमीनो स्तर पर समान है।

जैसा कि हम सभी जानते हैं कि होमोसैपिएंस और चिंपांज़ी बहुत करीब से जाने जाते हैं, यह भी अध्ययन से स्पष्ट है कि उनके पास है .. अमीनो एसिड स्तर पर समान रूप

से 1.35 और 0.65 प्रतिशत की अगली निकटतम आनुवंशिक दूरी। इसलिए, यह वास्तव में अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प बात है और इस बातचीत

में मैंने जो कुछ भी आपको बताया है, उससे आप हमेशा अधिक खोजबीन कर सकते हैं। इसलिए, एक अन्य महत्वपूर्ण उपकरण जो हम कार्यात्मक जीनोमिक्स (functional genomics) अध्ययन में उपयोग

करते हैं, एक पीसीआर चलाना है, जो आपके पास है जिसे डॉ। गणेश ने आपको व्याख्यान में पढ़ाया है। लेकिन एक पीसीआर (PCR) करने के लिए हमें

एक प्राइमर की आवश्यकता होती है। तो, हम एक प्राइमर कैसे डिज़ाइन करते हैं? तो, मैं आपको बताता हूं कि प्राइमरों

को डीएनए (DNA) या आरएनए (RNA) के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है जो जीनोमिक स्तर पर या ट्रांसक्रिप्ट स्तर पर डीएनए से कोडित होता है।

तो आज, मैं आपको बताऊंगा कि सेल में मौजूद एक प्रतिलेख को प्रवर्धित (amplilied) करने के लिए प्राइमर को कैसे डिज़ाइन किया जाए। तो यहाँ पर, आप एक पीसीआर (PCR) जेल देखते

हैं यह एक सामान्य पीसीआर जेल है जहाँ हमारे यहाँ डीएनए बैंड स्पष्ट हैं, जो एथिडियम ब्रोमाइड टिन से सना (stained) हुआ है जो यूवी प्रकाश में प्रकाशित होता

है। और पक्षों पर आप डीएनए बैंड के आकार को जानने के लिए सीढ़ी देखते हैं। तो, यह एक सरल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन है, जो

प्राइमर और डीएनए का उपयोग करके किया जाता है और फिर आपको पीसीआर (PCR) का उत्पाद दिखाने के लिए जेल पर लोड किया जाता है।

इसलिए प्राइमर को एक सेल में प्रतिलेख की उपस्थिति की मात्रा निर्धारित करने या पहचानने के लिए डिज़ाइन करना है। हमें इसके लिए एक प्राइमर डिजाइन करना

होगा। और, मैं आपको यहां दिखाऊंगा, मैं आपको यहां एक गपद्ध (GAPDH) नामक जीन के लिए एक प्राइमर डिजाइन करने के बारे में दिखाऊंगा,

जिसे सभी परिस्थितियों में व्यक्त करने वाला एक संवैधानिक जीन माना जाता है और इसका स्तर आम तौर पर विभिन्न परिस्थितियों में नहीं बदलता है सेल।

इसलिए मैं केवल गपद्ध (GAPDH) टाइप करूंगा, यह प्रोटीन गपद्ध (GAPDH) का प्रतीक है। यह ग्लाइकोलाइसिस चक्र में एंजाइमों में से एक है।

यहां पर जीन का चयन करें। इसलिए ये अलग-अलग प्रजातियों में अलग-अलग गपद्ध (GAPDH) हैं जिन्हें वे यहाँ सूचीबद्ध हैं और जिसके लिए कभी भी आप जिस जीव

को एक प्राइमर डिज़ाइन करना चाहते हैं, उस जीव का चयन कर सकते हैं। मैं यहाँ पर मानव का चयन करूँगा। तो आप देखते हैं कि इस जीन के बारे में

सारी जानकारी यहाँ सूचीबद्ध है। पूरा नाम ग्लाइसेरलडिहाइड 3 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज और आप यहाँ पर थोड़ा सारांश देखते हैं जो आपको जीन के ज्ञात कार्यों के बारे

में बताता है। आप नीचे ब्राउज़ कर सकते हैं और जीन के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन यहाँ हम पहले से डिजाइन

करना चाहते हैं, इसलिए हम इस अनुक्रम को पुनः प्राप्त करना चाहते हैं, इस जीन का आरएनए अनुक्रम। इसलिए हम यहाँ नीचे जाते हैं आप जीनोमिक्स

(genomics) अनुक्रम (sequence), आरएनए (RNA) अनुक्रम, प्रोटीन अनुक्रम सभी देखते हैं जो इस जीन के लिए सूचीबद्ध हैं। NM प्रतिलेख अनुक्रम का प्रतिनिधित्व

करता है। उस पर क्लिक करें। तो, यह सब इस जीन के mRNA के बारे में है। यह 1455 बेस जोड़ी लंबी mRNA है और इसके बारे

में नीचे सूचीबद्ध है। और हम इस mRNA के फास्ट (fasta) अनुक्रम को पुनः प्राप्त करने में रुचि रखते हैं। तो बस फास्ट (fasta) पर क्लिक करें, इसलिए

यह अनुक्रम mRNA अनुक्रम है जो हमने यहां प्राप्त किया है। इस क्रम को यहां से कॉपी करें, और वर्ड फाइल को यहां पर एक अनुक्रम पेस्ट करें।

अब सेल में mRNA स्तर का पता लगाने के लिए प्राइमर डिजाइन करते समय ध्यान रखने वाली एक महत्वपूर्ण बात यह है कि हम पीसीआर (PCR) में प्रवर्तित किसी भी गैर-विशिष्ट

बैंड को नहीं चाहते हैं जो हम डिजाइन करते हैं। इसलिए, विभिन्न एक्सॉन से प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए ध्यान में रखना आवश्यक

है जो बीच में इंट्रॉन में अलग-अलग एक्सॉन पैनिंग को बांधते हैं। तो, यह महत्वपूर्ण है क्योंकि इंट्रॉन को फैलाने की प्रक्रिया के दौरान क्लीवेज

को बाहर निकाल दिया जाता है, जिससे एक्सॉन एक साथ लिगेट हो जाते हैं, इसलिए परिपक्व (mature) एमआरएनए (mRNA) में केवल एक्सॉन को एक साथ सिला जाता है।

इसलिए यदि हम प्राइमर को अलग-अलग एक्सॉन से डिजाइन करते हैं तो हम यह सुनिश्चित करेंगे कि जो अंतिम एम्प्लिकॉन हम अपने पीसीआर पर प्राप्त करेंगे, वह वास्तव

में एमआरएनए से है न कि एक जीनोमिक सीक्वेंस से, जहां प्राइमर में अनलेड (anealed) हो सकता है। चूंकि, आरएनए नमूने में कुछ जीनोमिक

डीएनए संदूषण (contamination) से कुछ संदूषण (contamination) हो सकते हैं। और, अगर बीच में कोई इंट्रॉन मौजूद है तो यह एक विशाल आकार होगा और प्राइमर

कभी भी उस बड़े अनुक्रम को बढ़ा नहीं पाएंगे। इसके अलावा एक और बात जो महत्वपूर्ण है वह यह है कि जब हम mRNA अनुक्रम को बढ़ाने के लिए एक प्राइमर को डिजाइन करते हैं,

तो हम प्रायोगिक रूप से यह करते हैं कि हम आरएनए को अलग करते हैं और फिर सीडीएनए तैयार करते हैं। तो, और उस सीडीएनए से इस प्राइमरों

के लिए टेम्पलेट क्या है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि mRNA से सीडीएनए के संश्लेषण (synthesis) में, पोलीमरेज़ के पास हर समय बहुत अच्छी निष्ठा नहीं हो सकती

है और प्रतिलेखन को पूरा करने और mRNA प्रतिलिपि के अंत तक सीडीएनए के संश्लेषण (synthesis) को पूरा कर सकता है, और बस गिर सकता है नीचे।

तो, यह एक हमेशा एक अच्छा विचार है कि प्रतिलेख के अंत में प्राइमरों को डिजाइन किया जाए। चूंकि अंतिम 3 मुख्य छोर है क्योंकि रिवर्स

ट्रांसक्रिपटेस cDNA को संश्लेषित करना शुरू कर देता है, इसलिए हम दो एक्सन की तलाश करते हैं जो अंतिम हैं, जो ट्रांसक्रिप्ट के अंत की ओर मौजूद हैं।

इसलिए हम NCBI की वेबसाइट पर वापस जाते हैं जहाँ जीन के बारे में जानकारी दी गई थी और यहाँ अलग-अलग एक्सोन दिए गए हैं जो यहाँ सूचीबद्ध हैं, इसलिए पहला एक्सॉन

पहले बेस पेयर से 251 तक मौजूद है और इसी तरह से । हम नीचे जा सकते हैं और एक्सोन के लिए, दूसरा 352 से 458 towards तक का है और अंतिम छोर

तक जाने देता है इसलिए 1161 से 1435 तक हम इस जानकारी को अपनी शब्द फ़ाइल में कॉपी कर लेते हैं। और दूसरा आखिरी एक्सन से ठीक पहले 748 से 1160

तक है, बस आखिरी एक्सॉन से पहले पेस्ट करें। अब हमारे पास दो एक्सन की स्थितियां हैं और हम पिछली एक्सॉन से प्राइम्स, अंतिम एक्सन से फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइम्स

को डिजाइन करने का प्रयास करेंगे। इसलिए, शब्द हमें ऐसा करने में मदद करेगा और हमें न्यूक्लियोटाइड्स (nucleotides) की संख्या और एक पंक्ति में अनुमान लगाने की आवश्यकता

है और हम इसका चयन करते हैं। और, यह बताता है कि पहली पंक्ति में 17 न्यूक्लियोटाइड (nucleotide) हैं और हमें 748 तक जाने की आवश्यकता है, इसलिए हम 10 पंक्तियों

को गिनते हैं जो 700 होगी और 11 पंक्ति में 748 न्यूक्लियोटाइड (nucleotide) होंगे। यह उम्मीद है कि 11 पंक्ति है और हम यहां एक स्थान देते हैं।

बस इस बात की पुष्टि करने के लिए कि यह क्या है और हमें 48 तक जाना चाहिए। इसलिए हमें बस कुछ क्षेत्र का चयन करना होगा और यह 28 है इसलिए हमें और आगे जाने

की आवश्यकता है। यह 39 को एक स्थान देता है, इसलिए यह 48 है। इसलिए, वास्तव में यहाँ जगह खत्म हो जानी चाहिए क्योंकि 748 एक्सॉन (exon) से एक्सॉन

(exon) की सीमाओं को परिसीमन करने के साथ शुरू होता है और फिर यह तब तक चला जाता है जब तक कि यह दूसरा आखिरी एक्सन शुरू न हो जाए और।

इसलिए, यह वह क्षेत्र है जिसे हम प्राइमर डिजाइन करने में रुचि रखते हैं। इसलिए लक्ष्यीकरण को बढ़ाने के लिए आपको यह निर्धारित करने की आवश्यकता

है कि आपको किस प्रकार के उत्पाद का आकार चाहिए। तो, आप उत्पाद का आकार कम रखने के लिए हमेशा अच्छा होता है, ताकि पीसीआर के लिए स्थितियां

ऐसी निर्धारित की जा सकें कि जीन को आसानी से बढ़ाया जा सके। इसलिए, हम एक ऐसे क्षेत्र का चयन करेंगे, जिसमें हमें 100 से 200 बेस जोड़ी एम्प्लिकॉन मिल सकते

हैं और मैं प्राइमर डिजाइन करने के लिए इस क्षेत्र का चयन करता हूं। और अब, हम NCBI ब्लास्ट (BLAST) टूल, NCBI प्राइमर ब्लास्ट (BLAST) टूल पर वापस जाते हैं।

हम बस Google पर टाइप कर सकते हैं और आपको वह टूल मिल जाएगा। तो, यह टूल आपको प्राइमरों को टेम्पलेट अनुक्रम के साथ डिजाइन करने में मदद करेगा जो

आपको प्रदान करना है। यह टेम्प्लेट अनुक्रम है। हम उस एम्प्लिकॉन आकार को बदल सकते हैं जिसे हम चाहते हैं।

जैसे मैंने आपको 100 से 200 बेस पेयर के बारे में बताया और आप अन्य सभी विकल्पों को समान रख सकते हैं और प्राइमर्स प्राप्त करने के लिए क्लिक कर सकते हैं।

प्राइमर ब्लास्ट टूल प्राइमर को उस क्रम के लिए डिज़ाइन कर रहा है जो हमने प्रदान किया था। इसलिए, हम देखते हैं कि उपकरण ने हमें

अनुक्रम दिए हैं, गपद्ध (GAPDH) के विभिन्न आइसो रूप हैं जिन्हें प्राइमर की घोषणा की जा सकती है। इसलिए, हम या तो एक विशेष आईएसओ फॉर्म

का चयन कर सकते हैं, जिसे हम प्राइमरों को लक्षित करना चाहते हैं या यदि आप आम तौर पर जीन को लक्षित करना चाहते हैं, तो एक पूरे के रूप में हम चयन करने की कोई

आवश्यकता नहीं है। बस सबमिट पर क्लिक करें। इसलिए, टूल में हमारे लिए अलग-अलग प्राइमर्स जोड़े के लिए डिज़ाइन प्राइमर हैं, जो कि

टूल ने डिज़ाइन किया है और हमारा काम अब एक प्राइमर जोड़ी का चयन करना है, जो कि एक अच्छे प्राइमर की आवश्यकता को पूरा करता है, जिसे गैर-विशेष रूप से अन्य दृश्यों

से बाँधना नहीं चाहिए । जो, हम यहां उपलब्ध परिणामों से पता लगा सकते हैं, इसमें न्यूक्लियोटाइड (nucleotide) दोहराव की पुनरावृत्ति (repetition) नहीं होनी चाहिए जिसके परिणामस्वरूप

प्राइमर का आत्म-अनावरण होगा। और, न्यूक्लियोटाइड का एक समान वितरण होना चाहिए। यदि वे प्राइमर जीसी समृद्ध हैं, तो यह

खाका के बंधन और विकृतीकरण (denaturation) में कठिनाई पैदा करेगा। तो, ये ऐसी स्थितियाँ हैं, जिन्हें प्राइमर सेट उठाते समय हमें ध्यान में रखने की

ज़रूरत है। तो पहला वाला गपद्ध (GAPDH) के अलावा 179 बेस पेयर का है। यह दूसरे ट्रांसक्रिप्ट को भी अच्छी तरह से

बांधता है और आपके द्वारा देखे जाने वाले डॉट्स मैच के कारण होते हैं और निर्दिष्ट न्यूक्लियोटाइड (nucleotide) बेमेल होते हैं इसलिए हम इस प्राइमरी जोड़ी के लिए नहीं

जाएंगे। आइए हम दूसरे को देखें। यह एक 104 न्यूक्लियोटाइड (nucleotide) प्राइमर जोड़ी है, और यह अन्य प्रतिलेखन प्राइमर जोड़ी के

साथ मेल खाता है 3 बेस 110 जोड़ी है और यह देता है, यह अन्य टेप के साथ मेल खाता है, , लेकिन यह 3 के 3 kb से अधिक का एक बहुत बड़ा amplicon है।

जिसे उन परिस्थितियों से प्रवर्धित (amplified) किया जाना मुश्किल है जो हम इस प्राइमर के लिए निर्धारित करेंगे जो बहुत कठोर परिस्थितियों की तरह होगा।

तो, यह एक अच्छी प्राइमर जोड़ी है प्राइमर जोड़ी 3. फिर से प्राइमर जोड़ी 4 एक अच्छा विकल्प है, इसलिए यह है कि आप हमेशा कैसे तलाश

सकते हैं। इसलिए, प्राइमर जोड़ी 6 हमें कोई भी गैर-विशिष्ट मैच नहीं देती है, इसलिए यह एक अच्छा विकल्प प्रतीत होता है और अब हमें बस यह

करना है कि इन प्राइमर जोड़ी को यहाँ से चुनें। । और वापस जाएं और शब्द फ़ाइल में हमारे

अनुक्रम से मिलान करें और सुनिश्चित करें कि ये प्राइमर जोड़े वे अलग-अलग एक्सोन (exon) के लिए अनाउंस करते हैं, कि फ़ॉरवर्डानेल्स (forwardanneals) दूसरे अंतिम

एक्सॉन (exons) और रिवर्स एनील्स के लिए आखिरी एक्सॉन। तो, ऐसा करने के लिए हमें पहले 2 एक्सन की सीमाओं का निर्धारण करना होगा।

इसलिए, दूसरा अंतिम 1160 बेस पेयर तक है, इसलिए हम इन एक्सन को कलर भी कर सकते हैं ताकि कोई भ्रम न हो। यह पीला है और यह एक अलग रंग के लिए है।

और अब, हम देख सकते हैं कि हम प्राइमर जोड़े का मिलान कर सकते हैं ताकि आगे प्राइमर जोड़ी हो। चलो ... तो, यह प्राइमर जोड़ी है और फॉरवर्ड

इस क्रम से बिल्कुल मेल खाएगा, जो यहां पर है। जबकि, रिवर्स एक रिवर्स मानार्थ तरीके से अनुक्रम से मेल खाएगा।

इसलिए, हम रिवर्स प्राइमर के रिवर्स कॉम्प्लीमेंट ओरिएंटेशन (reverse compliment orientation) को पा सकते हैं। और, इसे यहाँ से कॉपी करें।

और फिर, आखिरी एक्सॉन के साथ इसे मैच करने की कोशिश करें। तो, यह वह जगह है जहाँ यह मेल खाता है। तो, हम प्राइमर डिजाइन करने में सफल होते

हैं जो अलग-अलग एक्सॉन से बंधते हैं और एनसीबीआई (NCBI) प्राइमर ब्लॉगर टूल में गैर-विशिष्ट मैच नहीं देते हैं। तो, यह है कि हम प्राइमरों को कैसे डिजाइन कर

सकते हैं और मुझे आशा है कि आपको इन दो कार्यात्मक जीनोमिक्स (functional genomics) टूल सीखने में मज़ा आया है जो आज की कक्षा में हैं। और, इस तरह के और उपकरण देखें और जाएं और

यदि आपके कोई प्रश्न हों तो आप हमें कोर्स पोर्टल पर लिख सकते हैं। धन्यवाद।